PRACTICA 7: DETERMINACION DE HB A1C POR CROMATOGRAFIA DE INTERCSMBIO IONICO.

PRACTICA NUMERO 7

24/10/17

OBJETIVO:

Lo que vamos a realizar en la separación del hemolizado por afinidades.

UTILIDAD CLÍNICA:

Una cromatografia es una técnica de separación de solutos disueltos en disolventes basadas en las diferentes afinidades que muestran dichos solutos por dos fases distintas denominadas móvil y estacionaria.

FUNDAMENTOS:

Después de preparar un hemolizado donde se elimina la fracción lábil, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio cationico, eluyendose de forma específica la hemoglobina A, previa eliminación por lavado de la HbA.

APARATAJE:

Fotometro:
Ya lo he comentado en la practica numero 1.

MATERIALES:

-Microcolumnas.

-Gradillas.

-Cubetas de espectofotometria.

-Pipetas y puntas de pipeta.

-Tubos de ensayo.

REACTIVOS:

Reactivo 1: 30 ml de biftalato 50 mmol/L, detergente, pH 5.

Reactivo 2: 50 ml de tampon fosfatos 45 mmol/L, pH6.5, azida sodica 0.95 g/L.

Reactivo 3: 450 ml de tampon fosfatos 72 mmol/L, pH 6.4, azida sodica 0.95 g/L

-Hemolizado.

PROCEDIMIENTO:

1.Invertir la cromatografia 10 minutos para compactar la resina y luego volver a volcar para sedimentar y dejarlo reposar unos minutos para que vuelva a su estado original.

2.Compactar el disco con una punta de pipeta con cuidado y abrir la tapa inferior y dejar caer el liquido sobre un tubo de ensayo.

3.Preparar en un eppendorf 50 microlitros de sangre y 200 microlitros de reactivo 1, agitar y dejarlo a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4.Preparar dos eppendorf y un tubo de ensayo con:

                - Primer eppendorf: 200 microlitros de reactivo 2.

                -Segundo eppendorf: 2 ml de reactivo 2.

                -Tubo de ensayo: 4 ml de reactivo 3

5.Cuando ha caido todo el conservante de la cromatografia introducir 50 microlitros de sangre hemolizada sobre el disco superior.

6.Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir 200 microlitros de reactivo 2.

7.Dejar gotear hasta que el reactivo 2 alcance el disco superior y desechar diluido.

8.Pipetear 2 ml de reactivo 2 y dejar gotear hasta que el reactivo 2 a alcanzado el disco superior y desechar el diluido.

9.Colocamos la columna sobre un nuevo tubo de ensayo y añadir 4 ml d reactivo 3 y recoger todo el diluido.

10.Agitamos el diluido y leer absorbancia a 415 nm frente a agua destilada.

11.Para preparar el patron, preparamos un tubo con 12 ml de reactivo 3 y 50 microlitros de hemolizador y agitar ( Se preparan dos para toda la clase).

12.Se lee abosrbancia del patron a 415 nm frente a agua destilada.

RESULTADOS:

Cuando hemos leido la absorbancia a 415 nm da el siguiente resultado:

             -Patron: 1.101

             -Muestra: 0.124

Calculamos:

(0.124/3x1.101)x100= 3.75% HbA.

Es un valor normal.

OBSERVACIONES:

La estimacion del porcentaje de la Hb a se realiza por lectura de la absorbancia a 415nm.