PRACTICA 12: INMUNODIFUSIÓN RADIAL
PRACTICA NUMERO 12
28/11/17
OBJETIVOS:
Identificación de proteínas por inmunodifusion radial ( Mancini).
Identificación de proteínas por inmunodifusion radial ( Mancini).
UTILIDAD CLINICA:
Comprobar la existencia de IgG en una muestra de suero y determinar su concentración, en caso de que exista.
Comprobar la existencia de IgG en una muestra de suero y determinar su concentración, en caso de que exista.
FUNDAMENTOS:
La inmunodifusion radial es una técnica que nos permite la identificación y cuantificacion de un antígeno concreto. En esta técnica, el antígeno se aplica en unos pocillos realizados en un gel de agarosa que contiene una concentración conocida de anticuerpo ( antisuero) especifico.
En cada pocillo, el antígeno aplicado difunde a través del gel de forma concentrica hasta alcanzar una zona de equivalencia con el anticuerpo, dando lugar a inmunocomplejos que forman un anillo de precipitado alrededor del pocillo.
El diámetro de cada pocillo es proporcional a la concentración del antígeno.
La inmunodifusion radial es una técnica que nos permite la identificación y cuantificacion de un antígeno concreto. En esta técnica, el antígeno se aplica en unos pocillos realizados en un gel de agarosa que contiene una concentración conocida de anticuerpo ( antisuero) especifico.
En cada pocillo, el antígeno aplicado difunde a través del gel de forma concentrica hasta alcanzar una zona de equivalencia con el anticuerpo, dando lugar a inmunocomplejos que forman un anillo de precipitado alrededor del pocillo.
El diámetro de cada pocillo es proporcional a la concentración del antígeno.
APARATAJE:
-Baño Maria.
-Microondas.
-Baño Maria.
-Microondas.
MATERIALES:
-Placas de petri de 55 mm.
-Pipetas automaticas y puntas de pipeta.
-Tubos eppendorf.
-Patrones de IgG ( 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml).
-Anticuerpos anti-IgG.
-Muestra de suero con concentracion de IgG.
-Agua destilada.
-Camara humeda.
-Placas de petri de 55 mm.
-Pipetas automaticas y puntas de pipeta.
-Tubos eppendorf.
-Patrones de IgG ( 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml).
-Anticuerpos anti-IgG.
-Muestra de suero con concentracion de IgG.
-Agua destilada.
-Camara humeda.
REACTIVOS:
-Agarosa.
-Tampon de inmudifusion radial.
-Agarosa.
-Tampon de inmudifusion radial.
PROCEDIMIENTO:
-Preparar los patrones de IgG y el antisuero anti-IgG que vienen en el kit ( descongelar).
-Preparar las placas de agarosa:
En un matraz de erlenmeyer añadir 1,5 gramos de agarosa y 100 ml de tampon y mezclar.
-Calentar en el microondas el erlenmeyer hasta su completa transparentacion, luego dejarlo enfriar hasta 45ºC y añadirle Anti-IgG Bovina.
-Cuando el erlenmeyer ha llegado a esa temperatura dispensar 8-9 ml por placa ( la placa debe estar situada sobre na superficie horizontal hasta su solidificacion, hay que procurar no hacer burbujas).
-Cuando la placa esta completamente solida realizarle cinco pocillo con la plantilla con ayuda de una pipeta ( a la que se la cortado un poco la punta para hacer mas grande los pocillos).
-Por otro lado, preparar 3 laminas de papel de filtro con la forma de la placa de petri.
-A continuacion, se le añade en el pocillo central 10 microlitros de suero sanguineo de concentracion 1/100.
-Por otro lado echar en los pocillos de alrededor los patrones ( unos 10 microlitros).
POCILLO 1: 0.05 mg/ml.
POCILLO 2: 0.1 mg/ml.
POCILLO 3: 0.4 mg/ml.
POCILLO 4: 0.4 mg/ml.
-Para hacer la difusion de Ag y Ac, colocar la placa con los patrones y muestra en una camara humeda durante 24 horas y observar los resultados. ( La camara humeda se realiza con papel de filtro y agua destilada )
-Sellar la camara humeda.
-Preparar los patrones de IgG y el antisuero anti-IgG que vienen en el kit ( descongelar).
-Preparar las placas de agarosa:
En un matraz de erlenmeyer añadir 1,5 gramos de agarosa y 100 ml de tampon y mezclar.
-Calentar en el microondas el erlenmeyer hasta su completa transparentacion, luego dejarlo enfriar hasta 45ºC y añadirle Anti-IgG Bovina.
-Cuando el erlenmeyer ha llegado a esa temperatura dispensar 8-9 ml por placa ( la placa debe estar situada sobre na superficie horizontal hasta su solidificacion, hay que procurar no hacer burbujas).
-Cuando la placa esta completamente solida realizarle cinco pocillo con la plantilla con ayuda de una pipeta ( a la que se la cortado un poco la punta para hacer mas grande los pocillos).
-Por otro lado, preparar 3 laminas de papel de filtro con la forma de la placa de petri.
-A continuacion, se le añade en el pocillo central 10 microlitros de suero sanguineo de concentracion 1/100.
-Por otro lado echar en los pocillos de alrededor los patrones ( unos 10 microlitros).
POCILLO 1: 0.05 mg/ml.
POCILLO 2: 0.1 mg/ml.
POCILLO 3: 0.4 mg/ml.
POCILLO 4: 0.4 mg/ml.
-Para hacer la difusion de Ag y Ac, colocar la placa con los patrones y muestra en una camara humeda durante 24 horas y observar los resultados. ( La camara humeda se realiza con papel de filtro y agua destilada )
-Sellar la camara humeda.
RESULTADOS:
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