PRACTICA 13: INMUNODOTTING PARA HEPATITIS AUTOINMUNES
PRACTICA NUMERO 13
14/12/17
OBJETIVOS:
UTILIDAD CLÍNICA:
El inmunodoting que vamos utilizar esta destinado a la detección en suero humano de auto-Ac tipo Ig G/ Ig M antimitocondriales dirigidos con los Ag M2/PDC nativo y M2 recombinante.
El inmunodoting que vamos utilizar esta destinado a la detección en suero humano de auto-Ac tipo Ig G/ Ig M antimitocondriales dirigidos con los Ag M2/PDC nativo y M2 recombinante.
FUNDAMENTOS:
La prueba se basa en el principio del Enzimoinmunoanalisis. Cada tira del test esta compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico. En dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, unirán específicamente al Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, se añade el sustrato que por acción de la enzima ALP, desarrollara una coloración purpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.
La prueba se basa en el principio del Enzimoinmunoanalisis. Cada tira del test esta compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico. En dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, unirán específicamente al Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, se añade el sustrato que por acción de la enzima ALP, desarrollara una coloración purpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.
APARATAJE:
Agitador.
Agitador.
MATERIALES:
-Bandeja de incubacion.
-Pipetas automaticas y puntas de pipeta.
-Pipetas Pasteur.
-Muestra.
-Bandeja de incubacion.
-Pipetas automaticas y puntas de pipeta.
-Pipetas Pasteur.
-Muestra.
REACTIVOS:
-Tampon de lavado concentrado 10X. (Tampon incoloro).
-Tiras dot.
-Tampon de dilucion.
-Conjugado.
-Sustrato.
-Tampon de lavado concentrado 10X. (Tampon incoloro).
-Tiras dot.
-Tampon de dilucion.
-Conjugado.
-Sustrato.
PROCEDIMIENTO:
-Colocar una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules de la tira mirando hacia arriba.
-Añadir 2 ml de tampon en en canal donde se encuentra la tira e incubar durante 10 minutos en agitación. Si se a realizado una buena incubación los puntos azules de la tira desaparecerán.
-Eliminar el liquido del canal con una pipeta pasteur succionando la bandeja. La tira se adhieren al fondo de los canales.
-Añadir 1,5 ml de tampon de dilucion el canal utilizado.
-Añadir 10 microlitros de muestra del paciente por el canal e incubar durante 30 minutos en agitación.
-Eliminar el liquido.
-Lavar 3 veces el canal con 1,5 ml de tampon de lavado y agitar. Después de cada lavado eliminar el liquido del canal
-Añadir 1,5 ml de conjugado por el canal utilizado e incubar durante 30 minutos en agitación.
-Eliminar el liquido del canal-
-Lavar 3 veces el canal utilizado durante 3 minutos cada vez con 1,5 m de tampon de lavado y agitar durante el lavado
-Añadir 1,5 ml de sustrato por el canal e incubar 10 minutos en agitación.
-Eliminar el liquido del canal-
-Lavar una vez mas durante 3 minutos con 1,5 ml de tampon de lavado para detener la reacción.
-Extraer la tira del canarl y dejarla secar en papel absorbente.
RESULTADOS:
Da un resultado negativo porque se debe comparar el punto correspondiente a cada antigeno especifico con el punto de control.
Esto es asi porque:
Una muestra negativa para un anticuerpo especifico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es menor o ogual a la intensidad de color del control negativo.
-Colocar una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules de la tira mirando hacia arriba.
-Añadir 2 ml de tampon en en canal donde se encuentra la tira e incubar durante 10 minutos en agitación. Si se a realizado una buena incubación los puntos azules de la tira desaparecerán.
-Eliminar el liquido del canal con una pipeta pasteur succionando la bandeja. La tira se adhieren al fondo de los canales.
-Añadir 1,5 ml de tampon de dilucion el canal utilizado.
-Añadir 10 microlitros de muestra del paciente por el canal e incubar durante 30 minutos en agitación.
-Eliminar el liquido.
-Lavar 3 veces el canal con 1,5 ml de tampon de lavado y agitar. Después de cada lavado eliminar el liquido del canal
-Añadir 1,5 ml de conjugado por el canal utilizado e incubar durante 30 minutos en agitación.
-Eliminar el liquido del canal-
-Lavar 3 veces el canal utilizado durante 3 minutos cada vez con 1,5 m de tampon de lavado y agitar durante el lavado
-Añadir 1,5 ml de sustrato por el canal e incubar 10 minutos en agitación.
-Eliminar el liquido del canal-
-Lavar una vez mas durante 3 minutos con 1,5 ml de tampon de lavado para detener la reacción.
-Extraer la tira del canarl y dejarla secar en papel absorbente.
RESULTADOS:
Da un resultado negativo porque se debe comparar el punto correspondiente a cada antigeno especifico con el punto de control.
Esto es asi porque:
Una muestra negativa para un anticuerpo especifico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es menor o ogual a la intensidad de color del control negativo.
OBSERVACIONES:
Evitar tocar la membrana de la tira con las puntas de la pipeta.
Evitar tocar la membrana de la tira con las puntas de la pipeta.
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